Como Eu Faço Qualidade: Controle Microbiológico da Água Reagente Segundo a Farmacopeia Brasileira Edição 2024

A qualidade da Água Reagente é tradicionalmente aferida segundo o documento CLSI  GP40. Contudo, diante da recente atualização do documento Farmacopeia Brasileira (FB),  a Água Reagente (Purificada) obtida a partir de água potável submetida a tratamentos,  ganhou parâmetros de controle microbiológico que já estão sendo exigidos por algumas vigilâncias sanitárias (VISA). “O laudo deve constar (sic) o determinado na Farmacopeia  Brasileira: contagem de número total de bactérias heterotróficas, ausência de  Pseudomonas e coliformes”. 

O controle da qualidade da água não se limita aos ensaios físico-químicos (como  Condutividade e Carbono Orgânico Total), mas exige uma vigilância rigorosa dos Testes de  Segurança (Capítulo 5.5.3.6 da FB) para prevenir o crescimento microbiano e a  contaminação ao longo do sistema. 

1. Requisitos de Pureza Biológica para Água Purificada 

A Farmacopeia Brasileira estabelece limites específicos para a Água Purificada,  garantindo que ela cumpra os testes biológicos requeridos: 

1. Contagem do número total de bactérias heterotróficas (5.5.3.6.1): O limite  máximo aceitável é de 100 UFC/mL. 

2. Pesquisa de Coliformes Totais e Fecais (5.5.3.6.2): Devem estar ausentes. 3. Pesquisa de Pseudomonas aeruginosa (5.5.3.6.3): Deve estar ausente. Vejamos a comparação entre o CLSI e a FB: 

2. A etapa crítica: Amostragem e Armazenamento 

A amostragem é uma fase crucial, pois a amostra retirada deve refletir fielmente o  desempenho do sistema de produção e distribuição de água. Uma amostragem  inadequada pode levar a avaliações errôneas da qualidade. 

O Plano de Amostragem: O plano deve prever a coleta de amostras desde o local de  geração da água até os pontos de uso, já que a qualidade pode variar significativamente 

ao longo do sistema. A coleta nos pontos de uso deve mimetizar as práticas de rotina,  incluindo a purga da válvula e o uso de mangueiras. 

Inicialmente, durante a validação do sistema, um plano de amostragem de curta duração  (por exemplo, duas a quatro semanas) e alta frequência é utilizado para caracterizar o  desempenho. Posteriormente, o plano de rotina deve ser periodicamente reavaliado com  base nos dados disponíveis, garantindo que a frequência e os locais de amostragem  sejam racionais e justifiquem a liberação da água. 

Coleta e Manuseio: As amostras devem ser coletadas em recipientes estéreis (vidro  borossilicato ou bolsas plásticas). É fundamental que agentes desinfetantes (como cloro)  sejam neutralizados antes da realização dos testes para permitir a recuperação adequada  dos microrganismos. A solução de tiossulfato de sódio a 3% é um agente neutralizante  comumente empregado. 

Condições de Armazenamento: Para manter as características microbiológicas, os  testes devem ser iniciados em até duas horas após a coleta. Se isso não for possível, a  amostra deve ser refrigerada na faixa de 2 °C a 8 °C por, no máximo, 12 horas.  Laboratórios terceirizados podem realizar o ensaio em até 24 horas, desde que a amostra  permaneça refrigerada. 

3. Métodos Microbiológicos em Detalhe 

A Farmacopeia Brasileira oferece métodos opcionais para a execução dos testes, cuja  escolha deve ser validada e baseada em estudos comparativos, utilizando o microbioma  nativo do sistema de purificação em análise. 

3.1 Contagem do Número Total de Bactérias Heterotróficas (CHT) 

O método selecionado deve ser adequado para a recuperação de microrganismos  específicos encontrados em sistemas de água. 

Meios de Cultura: Existem meios de alta concentração de nutrientes (copiotróficos),  como Ágar Caseína-Soja (TSA), Ágar PCA (Plate Count Agar) ou Ágar m-HPC, e meios de  baixa concentração de nutrientes (oligotróficos), como o Ágar R2A. O Ágar R2A é  especialmente indicado para a recuperação de bactérias oligotróficas. 

Condições de Incubação: A temperatura e o tempo são aspectos críticos. 

• Temperaturas baixas (20 °C a 25 °C ou 25 °C a 30 °C) por períodos mais longos  (pelo menos quatro dias) geralmente resultam em recuperações mais elevadas. 

• Meios de baixa concentração de nutrientes (R2A) requerem incubação mais longa,  pelo menos cinco dias. 

Procedimento para Água Purificada: O teste pode ser realizado por Profundidade em  Placa (utilizando 1,0 mL da amostra) ou por Filtração em Membrana (utilizando 100,0 mL  da amostra). Para a filtração, utiliza-se membrana estéril de 47 mm de diâmetro e 0,45 µm  de porosidade, devendo ser lavada após a filtração da amostra.

3.2 Pesquisa de Coliformes Totais e Fecais 

O grupo coliforme é definido como anaeróbios facultativos, bastonetes Gram negativos,  não formadores de esporos, que fermentam a lactose com formação de gás e ácido,  quando incubados por 48 horas a 35 ºC. 

Método de Fermentação em Tubos Múltiplos (NMP): 

1. Fase Presuntiva: Utiliza-se Caldo Lauril Triptose. A formação de turvação ou  produção de gás nos tubos invertidos (Durham) dentro de 48 ± 3 horas constitui  uma reação presuntiva positiva. 

2. Fase Confirmatória (Coliformes Totais): Tubos positivos da fase presuntiva são  inoculados em Caldo Lactose Bile Verde Brilhante. Crescimento e formação de  gás em 48 ± 3 horas a (35 ± 0,5) ºC confirmam a presença de coliformes totais. 

3. Fase Completa (Coliformes Fecais/ E. coli): Culturas positivas do Caldo Bile  Lactose Verde Brilhante são transferidas para Caldo EC ou EC-MUG e incubadas a  (44 ± 0,2) ºC. Crescimento e produção de gás neste meio indicam a presença de  coliformes fecais ou E. coli. 

Métodos Alternativos: Podem ser utilizados o método de Filtração em Membrana (com  meios como MacConkey, endo C ou eosina azul de metileno) ou métodos Cromogênicos,  baseados em substratos enzimáticos (como ONPG e MUG) para detecção simultânea e  em menor tempo. 

3.3 Pesquisa de Pseudomonas aeruginosa 

Este microrganismo deve estar ausente na Água Purificada. 

Procedimento: Utiliza-se o Método de Filtração por Membrana, filtrando-se 200 mL da  amostra. A membrana é transferida para o Ágar M-Pa-C. 

Incubação e Identificação: As placas são incubadas a (41,5 ± 0,5) °C por 72 horas. As  colônias típicas de P. aeruginosa são contadas (idealmente, de 20 a 80 colônias por filtro)  e caracterizadas por seu tamanho (0,8 mm a 2,2 mm), formato plano, borda clara e centro  de acastanhado a verde escuro. A confirmação final deve ser feita por meio de testes  bioquímicos adequados. 

Conclusão 

Recomendamos aos laboratórios clínicos que revisitem seus processos e  procedimentos de validação e de controle da qualidade da água reagente,  adequando-os também à Farmacopeia Brasileira. 

Referências 

1- CLSI GP40CLSI GP40 - Preparations and Testing of Reagent Water in the Medical  Laboratory. Date of Publication December 10, 2024 

2- Farmacopeia Brasileira, 7a. Edição aprovada pela ANVISA RDC 940/2024